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葡萄酒发酵期间白黎芦醇的变化研究

发布时间:2014-10-8  浏览次数:0 文章来源:百利生  

    摘要:采用HPLC直接进样、水/乙腈二元梯度洗脱方法同时检测葡萄酒发酵期间四种白藜芦醇异构体含量,发现:1)在15天的发酵期内,酒体中总白藜芦醇含量持续增加,至发酵结束后达到4.89mg/L,其中以白藜芦醇及其糖苷的反式异构体为主,含量达到4.59mg/L;2)发酵过程中反式白藜芦醇糖苷含量持续增加,而反式白藜芦醇在发酵至13天在2mg/L的含量水平上出现了溶出高峰,随后趋于平衡;3)由于原料的差异,不同年份的葡萄酒比较,白藜芦醇含量不同。


    白藜芦醇(resveratrol,3,4’,5-三羟基二苯乙烯)及其糖苷(piceid,3,4’,5-三羟基二苯乙烯-3-β-D-葡萄糖苷)是葡萄在生长过程中产生的次生代谢产物。近年来研究发现白藜芦醇对人类健康具有诸多积极作用,不仅可以降血脂[1] [2]、抗血栓[3] [4]、预防动脉粥样硬化和冠心病[5],还具有明显的预防、抑制癌症的作用[5] [6]。因为葡萄是白藜芦醇含量最丰富的食品之一,所以葡萄酒成为人类获得白藜芦醇的最直接、最广泛接受的食品。


    葡萄酒中的白藜芦醇是发酵期间由葡萄果皮转移到酒体中来的[7][8],葡萄品种[9]、葡萄种植的生态环境[10] [11]和葡萄酒酿造工艺[12] [13]都直接影响着葡萄酒中白藜芦醇的存在形态和含量,其中酿造工艺的影响最大,因此,葡萄酒中白藜芦醇的含量的高低,关键在发酵阶段[7] [12]。


    目前,关于葡萄酒中白藜芦醇的检测分析方法已有大量文献报道,但是针对葡萄酒中白藜芦醇同酿造的关系报道还很少[7] [8] [10] [11] [13 [14],本文结合国产干红葡萄酒的生产,采用HPLC直接进样方法检测了葡萄酒中的白藜芦醇种类和含量,以确定白藜芦醇在发酵期间的变化趋势。


    1.材料与方法


    1.1 实验材料


    赤霞珠葡萄(Cabernet Sauvignon),2002年10月采自河北省怀来县桑园镇。发酵菌种D254 酵母(S.serevisae-D254)。


    1.2 实验设备


    葡萄破碎机、发酵罐、物料泵


    1.3 仪器与试剂


    高效液相色谱仪(Waters公司600E型),配备二极管阵列检测器(PDA,Waters公司996型),Millennium32色谱工作站。


    反式白藜芦醇、反式白藜芦醇葡萄糖苷标样,纯度>99%,购自上海复旦大学药学院天然药物研究室。白藜芦醇及白藜芦醇糖苷顺式异构体标样参照Trela[15]的方法,由反式体标样经UV照射转化。


    甲醇、乙腈为Fisher公司产色谱纯,超纯水。


    1.4实验内容与方法


    白藜芦醇HPLC检测色谱条件:色谱柱为PINNACLE II C-18(250mm×4.6mm,5μm,美国RESTEK公司)。


    采用二元梯度洗脱,流动相A为水,用磷酸调节pH值至2.4,流动相B为含20%(v/v)流动相A的乙腈溶液。起始为82%流动相A,18%流动相B,保持5分钟;至10分钟时,流动相A为77%,流动相B为23%;15分钟时流动相A为75%,流动相B为25%;20分钟时流动相A为68%,流动相B为32%;30分钟时流动相A为100%,流动相B为0%;35分钟时流动相A为82%,流动相B为18%。流速为1.0mL/min。检测波长为306nm和288nm,室温检测。


    葡萄酒样品中白藜芦醇的检测:葡萄酒取样后,经0.45μm针孔过滤器过滤,直接进HPLC分析检测,进样量为50μL。


    2.结果与分析


    目前的研究认为,白藜芦醇的四种异构体(白藜芦醇顺反异构体和白藜芦醇葡萄糖苷的顺反异构体)都具有生理活性,因此一直受到同等的重视。但是由于顺式异构体标样性质不稳定,因此很难实现葡萄酒中四种异构体的同时定量分析。本研究在文献报道的基础上,通过紫外照射方法,获得了两种顺式异构体标样,采用HPLC直接进样、水/乙腈二元梯度洗脱方法,配合二极管阵列检测器在306nm处检测到了白藜芦醇四种异构体(图1),按照色谱出峰时间依次为反式白藜芦醇糖苷、顺式白藜芦醇糖苷、反式白藜芦醇、顺式白藜芦醇,其色谱特征同标准样品相同(图2)。


    图1 葡萄酒中白藜芦醇四种异构体色谱图 

    Fig 1 Chromatogram of resveratrol isomers in wine.


    图2. 白藜芦醇四种异构体色谱图

    Fig 2 Chromatogram of resveratrol isomers standards


    采用上述方法,对龙徽2001年赤霞珠干红葡萄酒进行检测(表1),其白藜芦醇总量达到6.64mg/L,其中白藜芦醇单体含量达到4.07mg/L,占总量的61.3%。根据Goldberg[11]的研究报道,这样的含量水平接近了法国波尔多和罗纳河谷产区(分别为6.18和4.53mg/L),高于意大利、西班牙以及中欧等几大产区(多在3.14%以下),

 

    结合北京龙徽葡萄酒厂赤霞珠干红葡萄酒生产工艺,对葡萄酒发酵过程实施白藜芦醇的监测。实验发现,发酵过程中总白藜芦醇(包含四种异构体)的含量始终在提高,其增加的趋势接近线性(图3),在15天的发酵期内,看不出酒体中总白藜芦醇含量的增加有停滞或平缓的趋势。因此,适当延长发酵时间、强化葡萄酒与皮渣的浸提作用,可以提高葡萄酒中白藜芦醇的含量。


    至发酵结束后葡萄酒中白藜芦醇总量达到4.89mg/L,低于2001年龙徽赤霞珠干红葡萄酒中的含量,由于生产工艺、设备相同,因此这种差异应当是葡萄原料造成的。二者的对比说明葡萄原料对葡萄酒中白藜芦醇存在较大的影响。

 

    图3 葡萄酒发酵期间白藜芦醇含量变化

    Fig 3 The concentration of resveratrol isomers during fermentation


    葡萄酒发酵期间白藜芦醇总量的持续增加是白藜芦醇和白藜芦醇糖苷等四种顺反异构体共同作用的结果,但其含量的积累主要来自于白藜芦醇及其糖苷的反式异构体的增加(图4、图5)。


    发酵过程中反式异构体含量的增加十分明显,特别是白藜芦醇糖苷,在发酵的后期,依然呈现较强的上升趋势(图4),这样的持续增加可能源于白藜芦醇单体的糖基化反应(白藜芦醇与葡萄糖反应生成糖苷);而反式白藜芦醇在发酵第13天在2mg/L的含量水平上出现了溶出高峰,随后趋于平衡,这可能同葡萄果皮的结构、白藜芦醇在果皮中的含量有关。至发酵结束时,两反式异构体含量之和为4.59mg/L,占白藜芦醇总量的93.9%。

 

    图4 发酵期间白藜芦醇糖苷含量的变化

    Fig 4 Change in concentration of cis and trans-pieceid during fermentation

 

    图5 发酵期间白藜芦醇含量的变化

    Fig 5 Change in concentration of cis and trans-resveratrol during fermentation


    有研究认为,白藜芦醇的顺式体是在发酵过程中产生的[12],其含量不受原料的影响,与发酵工艺有关。本实验从发酵第一天开始,白藜芦醇及糖苷的顺式异构体就在酒中检出,由于其含量微弱(0.2mg/L左右),变化曲线较平缓(图4、图5),对白藜芦醇总量的贡献很小,直至发酵结束,两种顺式异构体的含量之和仅达到白藜芦醇总量的6%。因此白藜芦醇及其糖苷的反式异构体是白藜芦醇研究和生产监控的重点。


    3.结论


    1.采用HPLC直接进样、水/乙腈二元梯度洗脱方法,能够检测到葡萄酒中四种白藜芦醇异构体。

    2.在干红葡萄酒发酵过程中,总白藜芦醇的含量持续增加,反式白藜芦醇存在溶出高峰,而反式白藜芦醇糖苷始终不断溶出。

    3.葡萄酒发酵过程中白藜芦醇含量的增加主要是两种反式异构体的增加,两种顺式异构体含量仅为总量的6%。 

    4.不同年份的葡萄酒中白藜芦醇的含量存在差异。


    参考文献

    1.Gehm B.D., McAndrews J.M., Chien P.Y., Jameson J.L. Resveratrol, a Polyphenolic compound found in grapes and wine, is an agonist for the estrogen receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. 1997,94:14138-14143


    2 .Frankel E.N., Waterhouse A.L., Kinsella J.E. Inhibition of human LDL oxidation by resveratrol. Lancet 1993,341:1103-1104


    3.板仓弘重 红葡萄酒的功与过 日本医学介绍 1997(18)1:18


    4.陈曾三 葡萄酒功能性研究最新动向 酿酒 1998,5:53-55


    5.刘树文 王华 葡萄与葡萄酒中白藜芦醇的研究进展 西北植物学报 1999,19(5):144-148


    6. Jang M., Cai L., Udeani G.O., Slowing K.V., Thomas C.F., Beecher, C.W.W. Cancer chemopreventive activity of resveratrol, a natural product derived from grapes. Science 275:218-220。 


    7. Siemann,E.H., and Creasy,L.L. Concentration of the phytoalexin resveratrol in wine. Am. J. Enol.Vitic. 1992,43(1):49-52.


    8. Jeandet P., Bessis R., Maume B. F., Sbaghi M. Analysis of resveratrol in Burgundy wines. J. Wine Res.1993,4:79-85.


    9 .Lamuela-Raventos R.M., Waterhouse A.L. Occurrence of resveratrol in selected California wines by a new HPLC method. J. Agric. Food Chem. 1993,41:521-523.


    10. Jeandet P., Bessis R., Sbaghi M., Meunier P. and Trollat P. Resveratrol content of wines of different ages: relationship with fungal disease pressure in the vineyard. Am. J. Enol. Vitic. 1995,46: 1-4.


    11. Goldberg D.M., Yan J., Diamandis E.P., Karumanchiri A., Soleas G. J. and Waterhouse A. L. A global survey of trans-resveratrol concentrations in commercial wines. Am. J. Enol. Vitic. 1995,46:159-165.


    12. Jeandet P., Bessis R., Maume B. F., Meunier P., Peyron D. and Trollat P. Effect of enological practices on the resveratrol isomer content of wine. J. Agric. Food Chem.1995, 43:316-319.


    13. Okuda T . Yokotsuka K . Trans-resveratrol concentrations in berry skins and wines from grapes grow in Japan. Am.J.Enol.Vitic, 1996 47(1):93-99


    14. Goldberg D.M., Ng E., Karumanchiri A., Ng, E., Yan J., Diamandis E.P.,Soleas G. J. Assay of resveratrol glucosides and isomers in wine by direct-injection high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 1995,708:89-98.


    15. Trela B.C,Waterhouse A. L., Resveratrol:isomeric molarabsorptivities and stability. J.Agric.Food Chem. 1996,44(5):1253-1257.

 
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